Obwohl Chris Redfield und Jill Valentine im Original Resident Evil die untoten Monster des Umbrella-Konzerns vernichten konnten, gingen die Experimente von Umbrella mit dem T-Virus ungehindert weiter. Claire Redfield, die jüngere Schwester von Chris, und Leon Kennedy, ein Polizeianfänger an seinem ersten Arbeitstag, kommen in der verschlafenen Stadt Raccoon City im Mittleren Westen an und müssen feststellen, dass die Stadt in flammenden Ruinen liegt, weil sich die Einwohner in hirnlose, fleischfressende Freaks verwandelt haben. Obwohl Claire und Leon ein Team bilden, werden sie bald getrennt und durch einen Autounfall in der Stadt eingeschlossen. Sie suchen Zuflucht in der Polizeistation von Raccoon City und müssen einen Weg finden, dem Albtraum zu entkommen, während sie gleichzeitig das Rätsel lösen, was mit Raccoon City passiert ist.
Neben der Zombiepopulation (die viel vielfältiger ist als im Original, einschließlich Teenager-Mädchen-Zombies, verrückten Cop-Zombies und sogar schmelzenden nackten Zombies), müssen Claire und Leon auch mit einer Vielzahl von freakigen Mutanten fertig werden, darunter riesige giftige Spinnen, wandelnde Venus-Fliegenfallen und schnelle, an Wänden krabbelnde Lickers. Jede Figur wird außerdem von einem scheinbar unaufhaltsamen Feind verfolgt: einem schrecklichen und sich ständig weiterentwickelnden Menschenmonster, das als „G-Type“ bekannt ist (Leons Szenario), oder einem wortkargen, aber unmenschlich mächtigen Umbrella-Agenten, der allerdings den recht kuriosen Namen Mr. X trägt (Claires Szenario).
Wie der Vorgänger ist auch Resident Evil 2 ein 3D-Action-Adventure mit dreidimensionalen Polygon-Charakteren vor zweidimensionalen, vorgerenderten Hintergründen, wobei das Geschehen in jedem Raum aus einer Vielzahl von filmischen, festen Kameraperspektiven betrachtet wird. Genau wie im ursprünglichen Resident Evil kann der Spieler in die Rolle eines von zwei möglichen Charakteren schlüpfen. Jeder Charakter durchläuft dasselbe Ausgangsszenario, unterscheidet sich aber in der Art der Waffen, die er findet, und in den Personen, die er auf seinem Weg trifft. Leon wird sich mit einer mysteriösen Frau zusammentun, die sich Ada Wong nennt, während Claire die Aufgabe hat, ein kleines Mädchen namens Sherry Birkin zu beschützen.
Im Gegensatz zum Original-Resident Evil wird nach dem ersten Durchspielen des Spiels ein zweites Szenario freigeschaltet, das mit dem nicht gewählten Charakter gespielt werden kann und neue Schauplätze, Karten, Feinde sowie ein längeres und kulminierenderes Ende enthält. Ihre Handlungen im ersten Szenario können auch den Ausgang bestimmter Ereignisse im zweiten Szenario beeinflussen. Außerdem gibt es mehr Munition und Heilgegenstände als im Originalspiel, obwohl man immer noch nicht genug Kugeln hat, um alle Gegner zu töten.