Vor fünf Jahren besiegte Richter Belmont, der jüngste des Belmont-Geschlechts und derjenige, der zum Vampirjäger bestimmt ist, Dracula in einem brutalen Kampf, der ihn beinahe die Liebe seines Lebens, Annette, und ihre Schwester Maria gekostet hätte. Nun ist Richter plötzlich verschwunden, Draculas Schloss ist auf mysteriöse Weise wieder aufgetaucht, und Maria, jetzt eine junge Frau, macht sich auf die Suche nach Richter. Alucard, der Sohn Draculas, erwacht nach dieser großen Machtverschiebung aus seinem ewigen Schlummer und dringt in das Schloss ein, um Antworten zu finden und sich seinem Vater zu stellen.
Symphony of the Night ist eine direkte Fortsetzung von Rondo of Blood. Im Gegensatz zu den vorherigen Teilen der Serie ist das Spiel in einem Schloss angesiedelt, das der Spieler auf vielen verschiedenen Wegen frei erkunden kann, auch wenn in bestimmten Bereichen oft Gegenstände gefunden werden müssen, die den Durchgang zu anderen Bereichen ermöglichen. Das actionbasierte Gameplay enthält nun auch starke RPG-Elemente. Der Held erhält Erfahrungspunkte für das Besiegen von Feinden, steigt auf und wird mächtiger. Es gibt auch Geld im Spiel zu finden und verschiedene Accessoires zu kaufen. In einem separaten Bildschirm müssen die Spieler Angriffswaffen, Schilde und andere Gegenstände ausrüsten. Magie spielt eine wichtige Rolle, ebenso wie Sekundärwaffen und eine große Anzahl von „Special Moves“, die ähnlich wie in fortgeschrittenen Eins-gegen-Eins-Kampfspielen ausgeführt werden.