Nach den Ereignissen des dritten Metal Gear Solid-Spiels, Metal Gear Solid 3: Snake Eater, isoliert sich Naked Snake von den Vereinigten Staaten und lässt sich in Kolumbien nieder. Hier gründet er Militaires Sans Frontières (Soldaten ohne Grenzen), eine private Militärgruppe, die Länder in Not unterstützt. Die Geschichte von Metal Gear Solid: Peace Walker wird die Ereignisse erklären, die dazu führen, dass Militaires Sans Frontières in späteren Spielen zu Outer Heaven wird, und auch, dass er endlich seine Rolle als Big Boss akzeptiert. Snake kämpft immer noch mit den Schuldgefühlen wegen des Mordes an einer Person, die ihm sehr nahe stand.
Eines Tages lernt Snake Ramón Gálvez, einen Friedenslehrer, und seine Schülerin Paz Ortega kennen. Die beiden wollen Militaires Sans Frontières um Hilfe für das Land Costa Rica bitten. Seit kurzem sorgt eine unbekannte bewaffnete Truppe mit Hightech-Waffen für Unruhe im Land, und da die Verfassung Costa Ricas eine Militärarmee verbietet, kann niemand etwas dagegen tun. Snake weigert sich zunächst, zu helfen, da er glaubt, dass dies zu weiteren Spannungen in Lateinamerika führen könnte, das nach Ansicht vieler das Herzstück der Machterhaltung in Ost und West ist. Doch als Gálvez ihm ein Tonbandgerät schenkt, auf dem versehentlich ein Gespräch zwischen zwei Frauen aufgezeichnet wurde, willigt Snake ein, da er glaubt, dass eine der Stimmen auf dem Band zu The Boss selbst gehört. Daraufhin begibt sich Snake auf eine Reise, auf der er nicht nur dem Land Costa Rica den Frieden zurückbringen will, sondern auch sich selbst.
Peace Walker ist zwischen den Ereignissen von Snake Eater und dem ursprünglichen Metal Gear angesiedelt. Snake wird mit dem Analogstick gesteuert und die restlichen Tasten variieren je nach gewählter Tastenkonfiguration: Shooter-Typ, Action-Typ oder Jäger-Typ. Das Gameplay ist das, was man normalerweise in der Metal Gear-Reihe sieht, nämlich die Bewegung auf Stealth-Basis. Das bedeutet aber nicht, dass man sich immer heimlich bewegen muss. Wenn man will, kann man einfach loslassen und mit verschiedenen Waffen, von der M16A1 bis zum Betäubungsstab, auf seine Feinde schießen. Die Zwischensequenzen werden in einem künstlerischen Comic-Stil präsentiert, der dem von Portable Ops ähnelt, wobei einige interaktiv sind.
Zu Beginn des Spiels erhalten Sie eine zentrale Mutterbasis, die Sie für eine Reihe verschiedener Dinge nutzen können. Von hier aus können Sie Ihr Spiel speichern, Waffen entwickeln und Quests in Angriff nehmen. Auf dem Missionsauswahlbildschirm können Sie frühere Missionen wiederholen, um eine höhere Punktzahl zu erreichen, und auch an zusätzlichen Missionen teilnehmen, die für die Haupthandlung nicht notwendig sind. Zwischensequenzen, die Sie im Laufe der Hauptkampagne gesehen haben, können Sie sich noch einmal ansehen. Das Entwickeln und Aufrüsten von Waffen erfolgt durch das Ausgeben von GMP, einer Währung, die man durch das Lösen von Quests erhält. In der Mother Base können Sie Ihre MSF-Mitarbeiter je nach ihren Fähigkeiten und Fertigkeiten in verschiedene Teams einteilen. Wenn du die richtigen Leute am richtigen Ort einsetzt, eröffnen sich dir mehr Möglichkeiten, weitere Gegenstände und Waffen zu entwickeln.
Der Mehrspielermodus im Spiel ist auf den Ad-hoc-Modus und den Koop-Modus beschränkt. Alle Story-Missionen können mit bis zu zwei Personen gespielt werden, die anderen Koop-Missionen mit vier Personen. Nachdem du bestimmte Missionen abgeschlossen und bestimmte Anforderungen erfüllt hast, kann Snake auf eine Insel gehen, wo du mit einigen Freunden auf die Jagd nach Monstern aus Capcoms Monster Hunter-Serie gehen kannst.